Роля на невроналната азотен-оксид синтаза за нормалните физиологични функции на сърцето



01/11/2015

д-р Александър Илиев*, доц. д-р Лазар Желев дм, доц. д-р Бойчо Ланджов дм, Георги Котов, проф. д-р Адриан Палов дмн, проф. д-р Димка Хинова-Палова дм

Катедра по анатомия, хистология и ембриология, Медицински университет - София

За контакти: E-mail: dralexiliev@abv.bg

Скоро след като е идентифициран като „мистериозният”, произлизащ от ендотела релаксиращ фактор за кръвоносните съдове през 80-те години на ХХ век, азотният оксид бързо придобива статута на една от най-важните сигнални молекули в сърдечносъдовата система.

Днес, повечето автори считат азотния оксид за медиатор на кардиопротекцията. Откриването (през 1999) на ензима невронална азотен-оксид синтаза, участващ в конститутивната продукция на азотен оксид в миокарда, води до изясняване на ролята на този медиатор в наблюдаваните промени в сърдечната морфология при нормални и патологични условия и в различни периоди от развитието.

Кислородните радикали и азотният оксид (NO) си взаимодействат, за да промотират благоприятен или патологичен ефект по отношение на миокарда. Какъв ще бъде този ефект се определя от различни фактори като количество освободен NO, клетъчен тип, изоформа на невроналната азотен-оксид-синтаза (NOS) и тип NO-донор, състояние на миокарда (норма, исхемия или сърдечна недостатъчност), редокс-състояние на средата, експериментални условия (in vivo или in vitro), наличие на едновременна beta-адренергична и/или мускаринова стимулация, нива на пред- и следнатоварване и други (1)*.

В последните години бе установено, че NO се произвежда в сърцето не само от съдовия ендотел, но и от самите кардиомиоцити (2, 3, 4). Конститутивната продукция на NO играе ключова роля в регулацията на сърдечната функция както при физиологични, така и при патологични условия (5, 6, 7, 8, 9).

До скоро се считаше, че ендотелната изоформа на азотен оксид-синтазата (eNOS) е единствената изоформа, която се експресира конститутивно в лявата камера на сърцето на бозайниците, където локализацията й се открива, поне отчасти, в инвагинации на сарколемата - кавеоли (10).

В началото на 90-те години, експерименти с неспецифични инхибитори на NOS върху изолирани плъши кардиомиоцити от лява камера, показаха усилен инотропен отговор на умерена beta-адренергична стимулация с изопротеренол (2), което показва, че конститутивното освобождаване на NO от миокарда може да служи като ендогенен инхибитор на beta-адренергичната сигнализация.

Изследвания върху NOS инхибиторите в кардиомиоцити от лява камера на морски свинчета, показват цикличен гуанозин монофосфат (цГМФ) зависимо увеличаване на амплитудата на калциевия ток през мембраната (11, 12). Това свидетелства за тоничния инхибиторен ефект на NO върху базовия инотропен ефект и калциевата медиация.

Тъй като конститутивните изоформи на NOS (ендотелна и невронална - eNOS и nNOS) се кодират от различни гени (13), несъответствията между резултатите, получени с неспецифични инхибитори на NOS и при селективна делеция на гена за еNOS, могат да бъдат обяснени ако се приеме едновременното съществуване на повече от една конститутивна изоформа на NOS в кардиомиоцитите на лява камера.

Xu и сътр. първи установяват наличието на продукт на гена NOS1 в миокарда на лява камера при някои бозайници, включително и човек. Това е NO, продуциран от nNOS, която всъщност е продуктът от изолирания ген (14).

Ролята на сигнализацията посредством NO в сърдечния мускул е важна в регулацията на куплирането на възбуждане и съкращение и beta-адренергичната сигнализация (15). Контрактилитетът на миокарда се повлиява по различен начин от nNOS и еNOS поради разликите в тяхната локализация и таргети на сигнализацията (16).

Куплирането на възбуждането и съкращението е високо координирана поредица от събития, която започва с възбуждането на отделни кардиомиоцити и завършва със съкращението на цялото сърце.

Характеристики на nNOS - експресия, активност и локализация

Невроналната NOS може да бъде фосфорилирана от протеинкиназа А (РКА) както in vitro, така и in vivo (17, 18). Все още не е ясно дали това има значим ефект върху активността на ензима (19). Освен това се предполага, че инхибиторите на РКА могат да се свързват с ендогенния инхибитор на nNOS (20, 21).

Въпреки това, подобно на еNOS, протеинът на топлинния шок 90 (HSP90) стимулира активността на nNOS чрез усилване на свързването на комплекса Ca2+/калмодулин към ензима.

Известно е и, че половите хормони като естрадиол повишават нивата на иРНК на nNOS (22). Но значението на пола за експресията на nNOS все още не е напълно обяснено. Изследване показва по-високи нива на експресията на nNOS в сърца на женски плъх в сравнение с мъжки плъх (23).

Според друго проучване, не се открива разлика между нивата на експресия в мъжки и женски сърца (24). Все пак, това несъответствие вероятно произтича от различията във вида на опитните животни (плъх и мишка) и/или вариациите на менструалния цикъл.

Известно е, че съществува тясна връзка между nNOS и калциеви йони (Ca2+) - транскрипцията на nNOS се регулира от Ca 2+ (25), а активността й е зависима от Ca2+.

Биосинтезата на NO включва електронен трансфер от С-терминалния (флавинов) към N-терминалния (хем) домен. Свързването на Ca2+/калмодулин вероятно предизвиква този електронен трансфер (26, 27), посредством изместване на автоинхибиращия компонент (28).

В допълнение, nNOS показва съвместна локализация с калций-свързани протеини; например в неврони, nNOS е закотвена към NMDA-рецепторните калциеви канали. Няколко проучвания показват имунохистихимично оцветяване на nNOS в кардиомиоцити (29, 30).

nNOS е локализирана по сарколемата и по мембраните на саркоплазмения ретикулум, където ко-имунопреципитира с рианодиновия рецептор (14, 31). При нормални физиологични условия, nNOS се открива по мембраните на саркоплазмения ретикулум.

Проучване на Damy и сътр. показа, че при патологични условия, nNOS може да се дислоцира от саркоплазмения ретикулум към сарколемата, което се показва чрез ко-оцветяване на nNOS със сарколемния маркер винкулин в модел на плъх с миокарден инфаркт.

При базални нива на вътреклетъчния калций, nNOS вероятно е неактивна, но активността й се повишава при покачване на калциевите нива (32, 33). Освен това, проучвания показват, че NO, синтезиран от миокардната nNOS, може да инхибира активността на Ca2+ АТФ-аза върху мембраните на саркоплазмения ретикулум (14).

От тези данни може да се заключи, че нарушаването на функцията на миокардната nNOS, ще доведе до получаването на фенотип, сходен с наблюдавания при аблация на физиологичния инхибитор на Ca2+ АТФ-аза - фосфоламбан.

Липсата на фосфоламбан води до по-бързо връщане на калция в цистерните на сарколазмения ретикулум на кардиомиоцитите на лява камера, последствие от което е повишаването на калциевото съдържание в ретикулума (34). В резултат на това се наблюдава повишен инотропен ефект в миокарда.

Ролята на nNOS е доста спорна. Асоциираната със саркоплазмения ретикулум nNOS (14) може да модулира сигнализацията посредством Ca2+. Предполага се, че nNOS вероятно упражнява тоничен инхибиторен ефект върху базалната регулация на калциевия ток през калциевите канали от L-тип и вътреклетъчните транзиентни калциеви токове (35), въпреки че тази роля на ензима е обект на дискусия (36).

Според някои проучвания, се наблюдава повишаване на клетъчния отговор към ниски дози beta-агонисти (37), докато други докладват за противоположен ефект при високи дози (31).

Изследвания на ко-имунопреципитацията и имунофлуоресценцията показват, че при нормален миокард nNOS може да бъде частично локализирана съвместно с рианодиновите рецептори по мембраните на саркоплазмения ретикулум и да взаимодейства с тях (31, 38, 39, 40).

Липсата на nNOS води до повишено диастолно излизане на Ca2+ посредством рианодиновия рецептор. Това повишено излизане може да доведе до намаляване на запасите на калций в цистерните на саркоплазмения ретикулум.

Установено е, че друг таргет на сигнализацията посредством nNOS са калциевите канали от L-тип. Невроналната NOS медиира намаляване на калциевия ток през каналите от L-тип, в резултат на което се намалява базалното съкращение, стимулирано от beta-адренорецепторите (35).

Доказано е, че nNOS взаимодейства и с протеини, които нямат отношение към куплирането на възбуждане и съкращение, например сарколемната калциева помпа 4b (41), която регулира активността на nNOS посредством модулиране на вътреклетъчните нива на калций.

Повишената експресия на помпа 4b понижава активността на nNOS и намалява отговора на beta-адренергична стимулация, с тенденция към намаляване на базалното съкращение (сходно с липсата на nNOS). Всички тези ефекти се реализират посредством цГМФ-независими сигнални пътища (42, 43, 44).

Или, nNOS модулира съкращението на кардиомиоцитите главно посредством цГМФ-независими сигнални пътища и нейни таргети са множество протеини, отговарящи за куплирането на възбуждане и съкращение, включително фосфоламбан, рианодиновия рецептор и калциевите канали от L-тип.

Роля на nNOS в контрола на базалното съкращение от страна на NO

Все още няма консенсус за ролята на NO върху сърдечното съкращение. Според някои проучвания, инхибирането на NOS няма ефект върху базалното сърдечно съкращение (45, 2, 46, 47, 48). Също така, не е документиран ефект на донорите на азотен оксид или на стимулирането на активността на NOS с L-аргинин върху базалната контрактилна функция на кардиомиоцити от лява камера на пиле (49).

Инхибирането на активността на nNOS, посредством разрушаване на гена или фармакологична блокада повишава базалния котрактилитет (37, 35). Този ефект се демонстрира при физиологични температури и при набор от сърдечни честоти. Това е важно обстоятелство, имайки предвид повишаването на активността на NOS с повишаване на честотата на стимулация (50), както и зависимостта от температурата на голям брой от процесите, участващи в куплирането на възбуждане и съкращение (51).

При липса на гена за nNOS, се наблюдава повишена систолна функция на лявата камера, съчетана с по-висока фракция на изтласкване (35). Тези данни частично се припокриват с тези на Barouch и сътр. от 2002 година.

Ефекти на nNOS върху ролята на калция в кариомиоцита и активността на рианодиновия рецептор

Механизмите, стоящи зад повишаването на контрактилитета при липсата на nNOS, са изследвани обстойно в изолирани кардиомиоцити от лява камера (35), където е показано, че положителният инотропен ефект при инхибиране на nNOS или разрушаване на гена, е свързан с ефектите на nNOS върху ролята на калция.

При разрушаване на гена за nNOS, както и при фармакологична блокада, се повишават калциевият ток през каналите от L-тип и натоварването на саркоплазмения ретикулум с калциеви йони.

Повишеното навлизане на калциеви йони посредством каналите от L-тип, при липса на nNOS, осигурява допълнителен стимул за калций-индуцираното освобождаване на калций и може да допринесе за по-голямо натоварване на саркоплазмения ретикулум, което да доведе до по-голям транзиентен калциев ток и по-силно съкращение.

Освен това, се предполага, че синтезираният от nNOS азотен оксид повишава активността на натриево-калиевата АТФ-аза (52, 53), което може индиректно да повлияе на калциевите токове, въздействайки върху вътреклетъчните нива на натрий, което води до промяна в активността на натриево-калциевия антипортер.

Според други изследователи, не се наблюдават такива промени по отношение на калциевата роля в миокарда при липса на nNOS. Данните на Sears и сътр. от 2004 година показват наличие на повишен калциев ток през каналите от L-тип при разрушаване на гена за nNOS или остра фармакологична блокада.

Ефекти на синтезирания от nNOS азотен оксид върху базалната релаксация

NO улеснява релаксацията на лявата камера и диастолното пълнене (54). При изолирани сърца от морски свинчета, коронарната инфузия на хемоглобин или на неспецифичен инхибитор на NOS улеснява увеличаването на минутния обем на сърцето (МОС), което е резултат от увеличеното преднатоварване, но не влияе върху базалния МОС (55).

От това следва, че NO улеснява реализирането на механизма на Франк-Старлинг посредством повишаване на левокамерния комплайънс. При наличието на остра фармакологична блокада или при разрушаване на гена за nNOS в кардиомиоцити от лява камера, се наблюдава отложена релаксация (37). Barouch и сътр. и Khan и сътр. не съобщават за нарушаване на релаксацията на лява камера при базални условия (31, 36).

Ефектът на NO върху релаксацията на лявата камера може би е резултат от цГМФ-медиирано намаляване на чувствителността на миофиламентите за калций, вероятно посредством PKG-медиирано фосфорилиране на тропонин I (56, 57). Според Zhou и сътр., синтезираният от nNOS азотен оксид вероятно стимулира активността и на Ca2+ AТФ-аза по мембраните на саркоплазмения ретикулум.

Роля на NO в контрола на сърдечния ритъм

Обикновено, ендогенният NO повишава сърдечната честота. Инхибирането на NOS с неспецифични инхибитори води по понижаване на сърдечния ритъм дори и при прерязани блуждаещи нерви (58). При заек, инхибирането на NOS води до брадикардия, независимо от фармакологичната блокада на вегетативните рефлекси (59).

Донорите на NO от друга страна, водят до повишаване на сърдечната честота. Наблюдава се повишаване на сърдечния ритъм на изолирани предсърдия от морски свинчета с няколко донора на NO (60). Допълнителни проучвания показват, че този ефект зависи от цГМФ и се медиира от повишаване на тока през пейсмейкърните канали (60, 61).

* В статията са използвани 61 източника. Пълен списък на статиите и на техните автори е на разположение в редакцията и ще бъде публикуван онлайн на www.spisaniemd.bg