Малигнен меланом – генетични характеристики



01/05/2014

Натрупващата се през последните години информация за генетичните характеристики на малигнения меланом дава нови насоки при диагностицирането на това заболяване и създава предпоставка за провеждане на персонализирана терапия със средства, насочени спрямо предварително идентифицирани мишени на тумора при отделния пациент, според обзорна статия, публикувана в списание Laboratory Investigation (1).

Малигненият меланом (ММ) е един от най-инвазивните злокачествени тумори, който е в състояние да избегне защитните механизми на организма. Добре известна е резистентността му към конвенционалните терапии.

MM не е едно заболяване, а съвкупност от хетерогенни патологични състояния. Така както всеки индивид е уникален, всеки меланом има уникално променен геном. Въпреки изразената генетична хетерогенност, на базата на наличните данни, могат да се дефинират отделни групи болни с ММ, които са със сходни молекулярни характеристики. Получаването на нови данни от проекта ENCODE* вероятно ще предостави повече информация по този въпрос.

Меланоцитите са клетки, прозхождащи от нервния гребен, които са отговорни за продукцията на меланин. Тяхна уникална характеристика е съдържанието на тирозиназа - ензимът, участващ в продукцията на пигмента.

По-голямата част от невусите, възникващи след раждането, имат мутация на BRAF гена, кодиращ една серин/треонин киназа, която играе важна роля в сигналния път на митоген-активираната протеин киназа (mitogen-activated protein kinase - MAPK). Тази мутация се означава като BRAF V600E.

Тя се среща при много злокачествени заболявания и при около 50% oт всички случаи на MM. Тъй като повечето придобити невуси не прогресират до MM, BRAF V600E мутацията е необходима, но сама по себе си не е достатъчна за възникването на MM - нужни са и допълнителни мутагенни събития.

Около 1% oт новородените имат вродени меланоцитни невуси (congenital melanocytic nevi - CMN), които могат да бъдат малки или да обхващат големи участъци от тялото. Мутации на NRAS онкогена са асоциирани не само с CMN, но също и с неврологични лезии, което показва, че единствено постзиготно събитие е отговорно за тези отделни нарушения. Има данни за конгенитална експресия на NRAS при малки деца с MM в мозъка.

В приблизително 10% oт всички случаи на MM се установява наследствена предиспозиция, като най-често участва 9p21 локусът, който кодира поне два отделни протеина, известни като p16INK4a и p19Arf. Първият протеин регулира активността на клетъчния цикъл, а вторият - стабилността на тумор супресорния протеин p53.

p16INK4a локусът може да регулира и продукцията на реактивни кислородни радикали (reactive oxygen species - ROS), които се установяват при липса на екзогенно индуциран оксидативен стрес.

Ролята на ROS при предизвикването на ДНК мутации при MM, независимо от експозицията на слънчева светлина, представлява интерес поради получените през последните години данни при мишки с червена козина (ginger mice), при които феомеланинът доминира над еумеланина.

Чрез използване на генотипно различни клонове мишки, е установено, че вероятно е налице и независим от ултравиолетовите (УВ) лъчи механизъм на канцерогенеза при ММ.

Различният пигментационен фенотип, който е резултат от промененото съотношение между феомеланина и еумеланина, отразява полиморфизми на гена за меланокортин 1 рецептор (melanocortin 1 receptor - MC1R) и на активността на тирозиназния ген, които могат до доведат до независима от УВ-лъчи канцерогенеза при мишките.

Нови данни за връзката между експозицията на УВ-лъчи и ММ

Невусите, взъникващи in utero, се развиват без излагане на слънчева светлина; следователно и CMN възниква независимо от експозицията на УВ-лъчи. Въпреки огромното количество данни, доказващи връзката между излагането на слънчева светлина (включително и солариум) и развитието на MM, едва през последните години е получена повече информация за подлежащите механизми.

УВ-лъчите оказват редица ефекти върху кожата, включително и изразено имуносупресивно действие, което вероятно играе сигнификантна роля в патогенезата на ММ.

Откриването на BRAFV600E мутацията при MM, обаче, поставя повече въпроси, отколкото отговорите, които дава. Въпреки че тя не е възникваща под влияние на УВ-лъчи (UV-signature) мутация, меланомите, при които тя се среща, са разположени в изложените на слънчева светлина участъци на кожата. Това сочи наличието на връзка между увреждането на ДНК и BRAF, която обаче все още не е уточнена.

В наскоро проведени проучвания бе установено, че около 70% от случаите на спорадичен и фамилен ММ, обусловен от УВ-лъчи увреждане, се установява в промоторния участък на гена за теломеразна обратна транскриптаза (telomerase reverse transcriptase - TERT). TERT регулира дължината на теломерите и поради тази причина допринася за продължителността на живот на клетките.

Генетични характеристики на ММ

Меланомните клетки могат да съдържат повече мутации, отколкото клетките на всеки друг малигном. Първият подробен скрининг за мутации в метастатична клетъчна линия на ММ (проект COLO-829) установи повече от 30 000 соматични замествания на бази, като почти 300 oт тях са в протеин-кодиращи последователности.

В миналото се смяташе, че само малък брой от driver-мутациите имат значение при MM, но геномният пейзаж бързо се разшири, като и вече включва множество различни мутации.

Необходимо е също така да се установи връзката между различните онкогени, асоциирани с меланомните клетки (например Notch, RAC1, GRIN2a, ERBB4, загуба на INK4a) и най-честите driver-мутации като BRAFV600E, NRAS, загуба на PTEN, NF1 нонсенс мутации, c-KIT, GNAQ или GNA11 мутации.

Различните молекулярни субтипове на меланома изискват персонализирани терапевтични стратегии. Въпреки че всички ММ произлизат от меланоцитите, driver-онкогените могат да показват съществени различия в зависимост от локализацията на тумора (например окото спрямо кожата) и нивото на експозиция на УВ-лъчи (хронична - по-често NRAS, остра - предимно BRAF и при условия на слънцезащита или при мукозна локализация - KIT мутации).

Сред дефинираните до момента генетични групи е налице изразена комплексност, със съобщения за съпътстващи мутации на множествени driver-онкогени (мутация на BRAF/загуба на PTEN, мутация на BRAF/мутация на CDK4, мутация на BRAF/амплификация на MITF). Tези сложни профили на мутация верояно ще изискват приложението на множествени лекарствени комбинации, които трябва да бъдат персонализирани за всеки отделен пациенти.

Патофизиология на ММ

Имайки предивид генетичното ранообразие на MM, е по-реалистично меланомните клетки да се разглеждат като притежаващи определени доминиращи сигнални пътища, които могат да бъдат атакувани. Патофизиологията на заболяването е сложна и е все още обект на изследвания.

Един от най-важните пътища в онкологията включва MAPK-сигналната каскада, в която участват наколко кинази, действащи координирано - RAS/RAF/MEK/ERK. Въпреки че сигналните пътища най-често се представят в опростен вид, трябва да се има предвид че те са комплексни, както и взаимодействията между тях.

MM се разлежда като имунно-чувствителен тумор (вероятно в резултат на големия брой мутации) поради документираните спонтанни ремисии и предишни съобщения за наблюдаван понякога отговор към терапията с интерферони, интерлевкини (IL-2) и клетъчно-базирани имунни терапии.

Не само имунитетът е от значение, но и възпалителните процеси в микросредата на тумора, които допринасят за пластичността както на туморните клетки, така и на имуноцитите, което е от значение както за хетерогенността на тумора, така и за терапевтичната резистентност.

Една важна причина за дешифриране на сигналните пътища е да се идентифицира „Ахилесовата пета“, чрез която множеството налични сигнални пътища, обуславящи преживяемостта на меланомните клетки, могат да бъдат преодоляни. Оптималните терапевтични средства са тези, които унищожават злокачествените клетки, а не водят само до цитостатични ефекти.

Клетките на MM притежават изобилие от механизми, осигуряващи тяхната преживяемост (Bcl2, Mcl-1) и инактивиращи пътищата на апотозата (Bad, Bak, Bim, Bmf, Noxa).

BRAF е генът, който най-често е мутирал при MM. Той кодира серин протеин киназа. Мутацията му, при която валин на позиция 600 в аминокиселинната последователност се замества от други аминокиселини, най-често от глутамат, е асоциирана с изразено повишение на конституционалната киназна активност и настъпване на клетъчна пролиферация при липса на растежни фактори.

Тъй като BRAF принадлежи към MAPK пътя, неговата повишена активност води до стимулиране на клетъчната пролиферация на MM. Инактивирането на NF1/неврофибромин действа съвместно с мутациите на BRAF при MM. Свръхактивацията на BRAF, в асоциация със свръхекспресия на CCND1/циклин D1, може да допринесе за метастазиране на меланома.

Един механизъм, чрез който мутантният BRAF може да окаже влияние върху преживяемостта на клетките на MM, е чрез понижаване на нивата на стимулиращите апоптозата протеини, като Bim и Bmf.

Важно е да се отбележи, че MM притежава пластичност при диференциацията си, подобно на стволовите клетки. Характерна за ММ е и изразената клетъчна хетерогенност - наличие на различни клетъчни клонове в рамките на една първична лезия или различия между първичния и метастатичния ММ, както и между различните метастатични лезии. Това геномно разнообразие създава както диагностични, така и терапевтични трудности.

Клетките на МM продуцират различни малки мембранни везикули, известни като екзозоми. Получените от ММ екзозоми (съдържащи TYRP2, VLA4, HSP70, MET и Rab27a протеини) могат да окажат влияние върху клетки и органи, разположени в съседство или в по-далечни локализации (лимфни възли, костен мозък), което води до увеличаване на метастазирането.

Диагностични проблеми

Златен стандарт при оценката на пигментираните лезии остава хистопатологичното изследване с микроскоп, въпреки че се разработват и алтернативни подходи.

Въпреки важността на светлинната микроскопия и подобрението на диагностичните критерии, все още се установяват различия в интерпретацията на пигментните лезии от различните изследващи, поради което е необходимо използването на допълнителния диагностични средства, преди да се постави диагнозата MM.

По-съвременните диагностични подходи включват приложението на имунохистохимия или флуоресцентна in situ хибридизация (FISH). Чрез имунохистохимичното изследване се определя наличието на специфични протеинови епитопи в биопсичните материали, но все още не е идентифициран маркер, който да може да различи бенигнени от малигнени невомеланоцитни лезии.

При FISH се използват специфични за определени ДНК-последователности флуоресцентни проби за детекция на наличието или липсата на хромозомни последователности, асоциирани с ММ.

През последните години вниманието се насочи към идентифициране и дори класифициране на ММ на базата на молекулярните абнормности на ниво ДНК и РНК. По отношение на диагнозата и терапията, все по-голям интерес представляват молекулните субтипове на ММ, отколкото хистологичните.

Епигенетичните модификации имат важна роля при ММ и могат да бъдат полезни прогностични биомаркери, като например загубата на 5-хидроксиметилцитозин в епигенома на ММ.

По отношение на епигенетиката и лечението на ММ, хистон деацетилазите (histone deacetylases - HDAC), които модифицират структурата на протеина, се очертават като терапевтични мишени. Инхибиторите на HDAC могат да бъдат от полза при преодоляване на лекарствената резистентност при пациенти с ММ с мутация на BRAF.

Вероятно новият златен стандарт за диагностицирането, за определянето на прогнозата и терапията на ММ ще се разпростре отвъд използването на микроскопа и ще се базира на рутинното използване на ДНК-секвениране.

Дори и в настоящия момент фиксирани във формалин и включени в парафин (formalin-fixed paraffin-embedded - FFPE) проби от MM (или от който и да е друг тумор) се изпращат до специализирани лаборатории, като е възможно извършване на секвениране на целия екзом и определяне на мутациите в рамките на две седмици.

Обещаващи са резултатите с използване на антитяло за локализиране и количествено определяне на BRAFV600E+ MM-клетките във FFPE пробите.

Разработват се различни терапевтични стратегии, базирани на установените генетични изменения, които целят създаването на лекарства с насочено действие при пациентите с MM.

Такъв медикамент, например, е vemurafenib (Zelboraf на Roche), който атакува меланомните клетки, носещи BRAFV600E мутация. Това е началото на нов подход при лечението - персонализирана терапия.

Към настоящия момент, се определя BRAF и NRAS статусът на пациентите и се избира подходяща таргетна терапия. При провеждането на лечение неизбежно има клетки, които не отговарят на терапията (escape) в резултат на селекция на предварително съществуващи резистентни клетъчни клонове или чрез адаптивни промени в сигнализирането или епигенетиката.

В бъдеще, краткосрочното медикаментозно лечение може да се комбинира с напреднали молекулни техники, които позволяват идентифициране на адаптациите чрез анализ на глобалното сигнализиране, реорганизацията на сигналните пътища и на циркулиращата ДНК. Тогава ще се разработят рационални лекарствени комбинации, които да позволят ограничаване на феномена „еscape“ и постигане на дългосрочна регресия на тумора.

Опитът с vemurafenib при пациентите с MM е асоцииран с няколко важни клинични наблюдения:

- изчезването и повторната поява на метастатичните лезии възникват толкова синхронно, че те сочат наличието на „биологичен часовник“, който показва времето на поява на лекарствена резистентност (точният механизъм все още е неясен)

- механизмите, обуславящи възникването на резистентност спрямо vemurafenib, са изключително разнообразни, поради което се смята, че резистентността се обуславя по-скоро от реорганизация на клетъчното сигнализиране, отколкото от възникването на геномно различни клонове

- vemurafenib има парадоксален ефект поради това, че инхибира мутантния BRAF, но активира дивия тип BRAF, и при клетките с активиран RAS той може да доведе до възникване на нови тумори като кератоакантоми и кожен сквамозноклетъчен карцином поради усиленото ERK-сигнализиране

Очаква се следващото поколение блокери на BRAFV600E да елиминират този парадокс (paradox-breakers), като не активират дивия тип BRAF киназа. В множество клинични проучвания се изследва възможността за провеждане на терапия с инхибитор на MEK, приложен самостоятелно или в комбинация с vemurafenib, или при болни с MM с резистентност към vemurafenib.

Предварителните клинични данни сочат, че комбинирането на BRAF инхибитор с MEK инхибитор увеличава преживяемостта без прогресия на заболяването в сравнение със самостоятелното приложение на инхибитор на BRAF. Насочената срещу MEK таргетна терапия може да бъде от полза и при пациентите с RAS-мутантен тумор.

Освен киназните инхибитори, американската FDA е одобрила и насоченото срещу CTLA-4 моноклонално антитяло ipilimumab (Yervoy на Bristol Myers Squibb) за приложение при MM.

Целта на последните имунотерапевтични средства е да се възстанови Т-клетъчния отговор спрямо туморните клетки, като по този начин се осигуряват достатъчно имуноцити, които да атакуват меланомните клетки.

Основни въпроси, очакващи отговор

Най-голямото предизвикателство е определянето на броя на заболяванията, които се крият под името MM. Има ли смисъл да се използва едно и също наименование за тумори, които произхождат от изложена на слънчева експозиция кожа, неокосмена кожа, ретина, мукози, нокътно ложе, в области на кожата, които не са изложени на УВ-лъчи?

Също така, много от MM всъщност са амеланотични и вероятно за тях трябва да се използва терминът „неврокристом“, последван от данни за геномния субтип. По отношение на меланоцитните кожни лезии, за патолозите невинаги е лесно да направят разлика между атипичен невус и ММ в ранен стадий.

Големите надежди за по-точно диагностициране се възлагат на извършване на ДНК-секвениране на целия геном.

Второто основно предизвикателство е разработването на комбинирани терапии, които да подобрят продължителността и качеството на живота на пациентите с напреднал ММ. За да се постигне тази цел, е необходимо меланомните клетки да се атакуват по-ефективно с комбинации от медикаменти.

Също така, трябва да се подобри разбирането и да се осигури превенция или поне отлагане във времето на развитието на придобита лекарствена резистентност.

Тъй като всяка меланомна клетка има повече мутации, отколкото клетките на която и да е друга неоплазма, е много трудно да се определят препоръките за терапия при наличието на хиляди соматични мутации.

Данните от проекта ENCODE, които показват, че 99% от некодиращата ДНК, разположена в така наречената тъмна материя (dark matter) на генома, всъщност допринася за взаимодействието между генетичния материал и карцинома, предоставят нови насоки пред терапията.

Все още не е ясно дали терапевтичните резултати, получени чрез изследване на част от първична или метастатична лезия, са приложими за цялостния клиничен отговор на пациента.

Предстои да се уточни и дали е възможно да отпаднат инвазивните процедури за поставянето на диагнозата и дали може да се разчита на детекцията на циркулиращи меланомни клетки в кръвни проби. (ЗВ)

* ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) е изследователски проект, който е стартиран от Американския национален институт за изследване на генома. Неговата цел е да идентифицира всички функционални елементи на човешкия геном. Смята се, че хората имат около 20 000 кодиращи протеини гени, които представляват около 1.5% от човешкия геном. Целта на ENCODE е да определи функцията на останалата част от генома.

Използван източник:

1. Pimiento J., Larkin E., Keiran S. et al. Melanoma genotypes and phenotypes get personal. Lab Invest 2013;93(8):858-867 http://www.nature.com/labinvest