Човешки ембрионални стволови клетки



01/12/2007
Човешкият организъм е изграден от около 200 вида соматични клетки, включени в различни тъкани, органи и системи. Освен тях съществуват и герминални (полови) клетки. В последните години все по-често се говори и за стволови клетки (stem cells), като темата често е обект на спекулации от страна на масовите медии. Името „стволова“ произлиза от виждането за ствола на растенията, който расте нагоре, удължавайки се, докато се разклонява и разлиства встрани. В чисто научен аспект, под термина стволови клетки (СК) най-общо се подразбира популация от ранни, недиференцирани родоначалници на „възрастните“ клетки. За да станат „възрастни“, те са длъжни да преминат процес на диференциация. Терминално диференцираните клетки по принцип не са способни към последващи митози и количеството им в организма се поддържа за сметка на деленето на слабодиференцирани предшественици. В зависимост от способността си за диференциация (в какви видове клетки могат да се превърнат), СК биват тотипотентни, плурипотентни, мултипотентни и прогениторни. Според източника на получаване, се разделят на две категории - ембрионални стволови клетки (ЕСК), включваща стволовите клетки на предимплантационния ембрион, и регионални (тъканноспецифични) стволови клетки. Тъканноспецифични СК са изолирани от над 20 тъкани и органи на човешки фетуси и възрастни индивиди. Те са източник на диференцирани клетки в определени части на организма през целия живот, включително и в етапа на ембриогенезата. В повечето случаи могат да се диференцират само в ограничен брой клетъчни линии (такива са например хемопоетичните или мезенхимните стволови клетки, получавани от костен мозък, периферна или умбиликална кръв). Използването им като средство за заместваща клетъчна терапия вече е намерило приложение в медицината. Те помагат за регенерацията на увредената тъкан и поддържането на хомеостазата. Ембрионални стволови клетки ЕСК – това са стволовите клетки на предимплантационния ембрион. Те дават началото на всички клетки и тъкани в организма. Плурипотентността на ЕСК е безспорно доказан факт за разлика от тъканноспецифичните СК на възрастния организъм. При трансплантация на животни ЕСК образуват тератоми (тумори, изградени от тъкани и на трите зародишни пласта), което е отражение на тяхната плурипотентност. ЕСК притежават значително по-голям потенциал за диференциация и огромен пролиферативен потенциал, което ги прави перспективен обект за нуждите на клетъчната терапия. Тези клетки имат способността за спонтанно и индуцирано насочена диференциация „in vitro“ с образуване на различни типове соматични и полови клетки (1, 2). При поддържане на клонирани човешки ЕСК (чЕСК) в продължение на осем месеца - от момента на получаването им и преминаването им за този период през 286 цикъла на клетъчно деление - те в пълен обем запазват потенциала си за диференциация. Клетките имат нормален кариотип, а също така експресират високи нива на теломераза (3). Историята Изследванията в областта на ембрионалните стволови клетки започват през 1963 година. Първоначално се използват дезагрегирани ембриони от зайци и мишки. По-късно са отработени методики за изолиране на вътреклетъчната маса на бластоциста (inner cell mass), която учените култивират както в интактен вид, така и като клетъчни дезагрегати. Първите линии ЕСК са получени през 1981 година от миши бластоцисти чрез култивиране на вътреклетъчната маса върху фидерен слой (4). По-късно са изолирани ЕСК от заек, плъх, свиня, крава и примати. Човешки ЕСК са получени за първи път през 1998 (5). Две години по-късно Reubinoff и сътр. потвърждават възможността чЕСК да бъдат изолирани успешно от предимплантационни ембриони, като същевременно демонстрират потенциала на тези клетки да се диференцират в различни клетъчни типове при „in vitro“ условия (6). В последващите години и други екипи съобщават за получаването на чЕСК. Проведени са множество експерименти с цел оптимизиране на условията за култивиране, манипулациите с генома и режимите за диференциация на клетките и използването им за трансплантация и тестване на лекарства (7-12). В момента броят на регистрираните линии е над 200, като част от тях се предлагат за продажба от различни компании (BresaGen, Cellartis, WiCell, ES Cell International, CyThera). Към Националния здравен институт на САЩ (NIH)* съществува регистър, в който са включени над 70 напълно характеризирани линии чЕСК. Получаване и култивиране на чЕСК ЕСК могат да бъдат получени от вътреклетъчната маса на ембриона (бластоцист) на предимплантационен стадий. На 5-6 ден след оплождането човешкият ембрион е изграден от 50-150 клетки (съответно ранен и експандирал бластоцист). Вътреклетъчната маса на такъв ембрион съдържа 20-60 клетки. Представлява пул от плурипотентни клетки, формиращи както самия ембрион и впоследствие възрастния организъм, така и редица екстраембрионални тъкани. Като източник на чЕСК в практиката се използват предимплантационни ембриони, получени „in vitro“. Чрез естествен „хетчинг“ или ензимна обработка на 5-7 ден след оплождането, бластоцистите се освобождават от zona pellucida. На следващия етап, с помощта на имунохирургия (използване на антитела) или механични (микроманипулационни) методи, се елиминират клетките на трофобласта. Изолираните вътреклетъчни маси се култивират върху предварително инактивиран фидерен слой клетки (най-често миши ембрионални фибробласти). За инактивиране на „фидерните“ клетки се използва 10 mcg/ml митомицин С за 90-120 минути или гама-стерилизация (4000-8000 rads). Като недостатък на метода се отчита животинският произход на фидерния слой. Поради тази причина все повече изследователи се ориентират към използване на човешки клетки за монослой – плацентарни фибробласти, утеринни ендометриални клетки, паренхимни клетки от гърдата, фетални фибробласти (от абортен материал), мезенхимни клетки от костен мозък и др. (13, 14). Предполага се, че фидерният слой секретира в средата все още неидентифицирани напълно растежни фактори (например LIF - leukemia inhibitory factor, bFGF - basic fibroblast growth factor), които подпомагат митотичната активност на ЕСК и задържат тяхната диференциация. Възможно е използването и на кондиционирана среда. Фидерният слой или кондиционираната среда се подготвят предварително (15). За разлика от мишите, чЕСК не могат да бъдат култивирани поединично. Те растат във вид на обемни колонии (куполовидни), изпъкващи над повърхността на монослоя. Колониите са с ясно очертани краища и плътни контакти между клетките. Характерно за чЕСК е високото ядрено-цитоплазмено съотношение, с 1-3 проминиращи нуклеоли. Най-често чЕСК се култивират в петриеви панички или 6-ямкови плаки. Желателната гъстота е 200-250 колонии за 35 мм петриева паничка и 500 колонии за 60 мм (когато се използва висока плътност на фидерния слой). При тази гъстота най-добре се запазва общият недиференциран статус на културата (16). За култивиране на клетките се използват специални среди, в които серумът е заменен със синтетични заместители (SSR - synthetic serum replacement). Известно е, че използването на фетален серум повишава риска за спонтанна диференциация на клетките. Важно е и допълнителното обогатяване на средата с някои субстанции (4 ng/ml basic fibroblast growth factor, 1-2 mM glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.1 mM beta-mercaptoethanol, 50 IU/ml penicillin + 50 mcg/ml streptomycin и др.). Колониите могат да са различни морфологични типове в зависимост от плътността на монослоя, върху който се култивират. При висока плътност на монослоя се наблюдават плътни, куполовидни колонии. При разрастване на колонията се формира вдлъбнатина в центъра. След 5-6 дни размерът на колонията нормално е 0.5-2.0 мм в диаметър. В идеалния случай колониите покриват цялата повърхност на плаката с малки интервали между тях. При по-ниска плътност на фидерния слой се наблюдават плоски, хоризонтални колонии. В този случай се използва и по-ниска посевна гъстота на колониите, тъй като те са по-широки (приблизително по 150 колонии в 35 мм петриева паничка). В клетките се наблюдават добре видими нуклеоли. И в двата типа колонии клетките експресират плурипотентни маркери и могат да образуват ембриоидни телца. Колониите растат бързо, като стволовите клетки се делят на всеки 15-18 часа. При покриване на 80% от дъното на плаката следва да бъдат пасирани чрез: * микродисекция (с помощта на стереомикроскоп). Колониите се отделят механично * използване на ензими (колагеназа тип IV – 1mg/ml). Целта е, след откъсване на клетките от монослоя, колониите да се „обелят“ от обкръжаващите ги клетки Трябва да се внимава колониите да не се дисагрегират на единични клетки. Нормално е да са на по 20-100 клетки. При всеки пасаж диференцираните колонии се отделят. Така се запазва общият недиференциран статус на културата. В колониите с частична диференциация се отделят областите с клетки, започнали да се диференцират. Критериите за спонтанна диференциация най-често са морфологични. Криоконсервация Дълготрайното съхранение на чЕСК и обменът на клетъчни линии между лабораториите налага криоконсервацията им. Чрез замразяване могат да бъдат запазени и някои специфични клонове, получени от оригиналните клетъчни линии или чрез генно модифициране. Конвенционалните методи за криоконсервация на клетъчни култури под защитата на 10% диметилсулфоксид (DMSO) се характеризират със сравнително ниски скорости на охлаждане и бързо размразяване. Показано е, че освен за соматични клетки, тези методи са ефективни и за замразяване на ЕСК от мишки (17). За разлика от мишите, колониите от чЕСК трудно могат да бъдат дисагрегирани на отделни клетки, които да дадат началото на продължителна култура. Те са доста по-чувствителни към факторите на процеса на нискотемпературна консервация, отличават се със сравнително малък клетъчен обем и лесно се диференцират. При използване на рутинни режими за замразяване не повече от 20-25 % от тях запазват виталността си (16). Има данни, че при класическите технологии за криоконсервация на клетъчни култури (бавно замразяване под защитата на DMSO и бързо размразяване) се наблюдава спонтанна диференциация на ЕСК (18). Независимо от тези трудности, има доста съобщения за успешна криоконсервация на чЕСК. Колониите чЕСК се отделят от фидерния слой механично или чрез ензимна обработка. Отделените колонии се промиват и пренасят в среда за криоконсервация. Замразяването се извършва най-често с помощта на програмен замразител (бавни скорости на охлаждане). В последните години се появиха данни за успешна витрификация (свръхбързо замразяване) на чЕСК (19-21). Ефективността на метода е по-висока от тази на програмното замразяване (22). При витрификацията най-често се използват криопротективни среди и режими, близки до тези за предимплантационните ембриони. Характеризиране на чЕСК Отличителна черта на ЕСК е тяхната тотипотентност - способността да се диференцират във всички видове клетки, тъкани и органи на възрастния организъм. Това обяснява и огромния интерес на учените към този вид клетки. В резултат на задълбочени проучвания са установени редица свойства, характерни за чЕСК. На първо място – това е високият им пролиферативен потенциал и теломеразна активност. Теломеразата е рибонуклеопротеин, добавящ крайни повторeния (TTAGGG) към теломерите на хромозомите, като по този начин поддържа дължината им на постоянно ниво. С този фермент е свързана „безсмъртността“ на ЕСК. За характеризиране на линиите чЕСК, наред с кариотипизирането, се изследва и експресията на различни маркери (23). Основните клетъчноповърхностни маркери, които се изследват за недиференцираните чЕСК са: * aлкална фосфотаза - за продължаваща пролиферация на клетките * SSEA-3 и SSEA-4 - повърхностни стадийспецифични антигени * TRA-1-81, TRA-1-60 - повърхностни антигени, открити първоначално в клетките на човешки ембрионални карциноми * OCT-4 - POU-транскрипционен фактор, регулиращ тотипотентността на ембрионалните клетки Характерно за чЕСК е, че не експресират SSEA-1 (24). Този маркер се използва като негативен контрол в изследванията. Перспективи пред използването на чЕСК Макар че малигнизираните линии човешки клетки като цяло са общодостъпни за експерименти, наблюдава се липса на първични диплоидни култури. Това прави чЕСК ценен и потенциално неизчерпаем източник на диференцирани нетрансформирани клетки с нормален кариотип за нуждите на изследователите. ЕСК са превъзходна система за определяне на функциите на гените в процеса на диференциация. Способността на чЕСК да се диференцират във всички видове клетки на възрастния организъм обяснява огромният интерес към тях. В „in vitro“ условия, при отделяне от фидерния слой, това свойство на чЕСК започва да се проявява с образуването на ембриоидни тела, които представляват сферични конгломерати от клетки, намиращи се на начален стадий на диференциация. Структурата на ембриоидните тела е близка до тази на ембрионите на ранен постимплантационен стадий. При пренасянето им върху повърхност, покрита с желатин, те се прикрепят към субстрата и започва процес на миграция на клетките. След около 10-дневно култивиране се образуват много диференцирани производни – предшественици на „възрастните“ клетки. Процесът на диференциация в този случай има хаотичен характер. Установено е, че клетките в процеса на миграция от ембриоидните тела са особено чувствителни към въздействието на различни индуктори на диференциацията. Поради това основно внимание се отделя на изследване на факторите, повлияващи диференциацията в определено направление. Знае се, че такива растежни фактори, като активин-А и TGFb-1 предизвикват диференциация предимно в производни на мезодермата, EGF, BMP-4, bFGF – в производни на мезо- и ектодермата, NGF – в производни и на трите вида зародишни тъкани и т.н. В последните години се увеличават съобщенията за успешна насочена диференциация на чЕСК в определен вид клетки и тъкани (нервни клетки, кожа, кератиноцити, мускулни клетки) (25, 26). Възможността за насочена диференциация на чЕСК в инсулинпродуциращи клетки дава надежда за хората с диабет тип 1. Тази форма на заболяването се дължи основно на автоимунно разрушаване на бета-клетките на панкреаса, с последваща инсулинова недостатъчност и пълна зависимост от лечението с екзогенен инсулин. За сега единственият кардинален метод за лечение на диабет тип 1 е трансплантацията на Лангерхансови острови. Достъпността на метода е ограничена поради липсата на донорски материал. Линиите чЕСК могат да станат неизчерпаем източник на материал за клетъчната терапия на такива болни. Още през 2001 израелски учени доказаха потенциала на чЕСК да се диференцират в инсулинпродуциращи клетки (10). Друго активно проучвано направление е възможността за получаване на кардиомиоцити от чЕСК. „Възрастните“ кардиомиоцити излизат от клетъчния цикъл и не могат да се регенерират. Значителните загуби на кардиомиоцити са невъзстановими и водят до развитието на прогресираща сърдечна недостатъчност. Нов терапевтичен подход към лечението на това заболяване е увеличаването на функционалната активност на миоцитите в района на некроза чрез имплантация на миогенни клетки. Ощe през 1996 година американски учени от Института по кардиология в Индианаполис разработват оригинален метод за получаване на кардиомиоцити от миши ЕСК. През август 2001 в The Journal of Clinical Investigation е публикувана статия от израелски учени, които съобщават за получаването на кардиомиоцити от чЕСК. Интерес представляват изследванията, свързани с получаването на нервни клетки. чЕСК могат успешно да се диферeнцират „in vitro“ в неврони, астроцити и олигодендроцити (27). Получените от чЕСК невроепителиални клетки притежават фенотипен профил, подобен на тези във възрастния организъм и експресия на SOX1, SOH2 и SOX3 гени. Те са позитивни за Nestin (неврален интермедиален филаментов протеин) и Musashi-1 (неврален РНК-свързан протеин) (28). Получените „in vitro“ зрели неврони експресират също така NF-L (белтък, характерен както за зрелите, така и за незрели неврони), NF-N (протеин в зрелите неврони), допаминови рецептори DRD-1 и серотонинови рецептори 5HT2A и 5HT5A, DDC (декарбоксилаза – ключов ензим, участващ в синтезата на невротрансмиторите) и др. Установено е, че добавянето на ретиноева киселина и нервни растежни фактори водят до увеличаване на количеството получени от чЕСК неврони спрямо контролата. Научните достижения в тази област дават надежди за лечението на заболявания като болестите на Паркинсон и Алцхаймер, черепно-мозъчни травми, множествена склероза, инсулти… Хемопоетичната деференциация на чЕСК може да има важно терапевтично значение, тъй като ще осигури получаването на неограничени количества еритроцити и тромбоцити за трансфузия и хемопоетични СК за трансплантация. Установено е, че чЕСК могат да се диференцират „in vitro“ в хематопоетични прекурсори (29). Методологията включва ко-култивиране със стромални клетки и използването на цитокинови „коктейли“, VEGF и BMPs. Наскоро учени от университета в Нюкасъл съобщиха за раждането на мишки след оплождане, настъпило с получени от ЕСК сперматозоиди. Това е още едно доказателство за плурипотентността на ЕСК. чЕСК са изключително привлекателен обект за нуждите на регенеративната медицина. Трансплантацията на ЕСК или получени от тях деривати не предизвиква имунна реакция от страна на реципиента (30). Вече се провеждат експерименти по пренасяне на ядра на соматични клетки в ЕСК. Получените хибриди притежават генотипа на донорната соматична клетка, запазвайки при това свойствата на реципиентните стволови клетки (31). Получаването на гамети от СК дава надежда на много безплодни двойки да се сдобият със собствено дете. В момента в много страни (Великобритания, Япония, САЩ) се оборудват лаборатории за създаване на годни за клинично използване линии чЕСК. Неотдавна сингапурската компания ESI обяви, че е създала четири нови линии чЕСК, предназначени специално за клиничната практика. Очаква се в близко бъдеще, с помощта на ЕСК, да бъдат постигнати значителни успехи в лечението на над 70 заболявания при човека. Всичко това предполага разширяване и задълбочаване на изследванията в тази област. Финансиране и законова регулация на изследванията с чЕСК Правителствата на повечето страни разбират важността и подкрепят проучванията в областта на чЕСК. През последните седем години Европейският съюз (ЕС) е отпуснал около осем милиона евро за девет проекта за изследване на стволови клетки в Белгия, Швеция и Великобритания. През юли 2006 министрите от страните членки на съюза приеха решение да продължат финансирането на подобни експерименти до 2013 година. Най-активно това решение бе подкрепено от Белгия, Финландия, Франция, Испания, Швеция, Великобритания и Португалия. В рамките на над 50-милиардния научен бюджет на ЕС ембрионалните експерименти ще бъдат финансирани с около 0.4% от шестте милиарда евро, предвидени за развитие на медицината. Останалите европейски държави също подкрепят разработките в тази област (включително и нечленки на ЕС като Швейцария и Русия). Против финансирането на изследванията на чЕСК или за частичното му ограничаване са Германия, Австрия, Италия, Литва, Люксембург, Малта, Полша и Словакия. Това са страни със силно влияние на католическата църква, която е против изследванията с човешки ембриони. Основните морални и религиозни догми са свързани с въпроса дали унищожаването на човешки ембриони, независимо че са на по 5-6 дни, е научна дейност или убийство. За опонентите бластоцистът не е просто струпване на клетки, а човешко същество и затова е неморално убиването му, дори в името на прогреса (32). В САЩ 70% от жителите подкрепят изследванията в областта на чЕСК. Отчитайки отношението на обществото към тази тема, през юли 2006 година Сенатът прие Закон за отделяне на допълнителни средства за изследвания на чЕСК. Според повечето сенатори, подобни научни разработки откриват нови възможности за лечение на заболявания, като болестите на Паркинсон и Алцхаймер, травми на гръбначния мозък, диабет тип 1. Но няколко дни по-късно президентът Буш за първи път от пет години се възползва от правото си на вето и стопира този закон. В момента предстои второ гласуване на закона. В България няма закон, регулиращ изследванията в областта на чСК. Както за научни експерименти, така и в медицинската практика (за трансплантации) в нашата страна се използват основно регионални СК, получени от кръв или костен мозък. Независимо от по-добрите перспективи, изследванията върху чЕСК все още са малко. Ограниченията са най-вече от финансов и организационен характер (трудности с получаване на материала – предимплантационни ембриони, сътрудничество между звената и др.). Подобен род изследвания се провеждат в Института по биология и имунология на размножаването в рамките на проект, наблюдаван от БАН – „Пилотни криобиологични проучвания на човешки ембрионални стволови клетки“. Като цяло българското правителство подкрепя изследванията в областта на чЕСК. Това се посочва в българската позиция по повод на научните изследвания, включващи човешки ембрионални стволови клетки, която бе представена от вицепремиерът и министър на образованието и науката Даниел Вълчев на извънредното заседание на Съвета на Европейския съюз по конкурентноспособност в частта „научни изследвания“ през юли 2006 в Брюксел. В становището се уточнява, че България напълно подкрепя позицията да бъдат финансирани научни дейности, целящи създаването и използването на човешки ембриони за изследователски нужди или за добиване на стволови клетки, включително чрез ядрен трансфер, като това напълно отговаря на българския Закон за здравето. Несъмнено приемането на закон за Асистираната репродукция, рeгулиращ и използването на чЕСК, би допринесло за разширяването и регламентирането на този род проучвания. Пламен Тодоров, доктор по биология Институт по биология и имунология на размножаването - БАН, София Е-mail: plamen@ivf.zzn.com В статията са цитирани 31 източници. Електронна версия на пълната библиография можем да изпратим на всички читатели, които ни пишат.