Диагностициране на Mycobacterium tuberculosis и установяване на мултилекарствена резистентна туберкулоза



01/08/2007
Контролът върху мултилекарствената резистентна туберкулоза (multidrug-resistant tuberculosis – MDR-TB)* трябва да бъде повишен поради увеличаващите се резистентни щамове, според доклад на Световната здравна организация (WHO), представен на годишната конференция за ретровирусни и опортюнистични инфекции, проведена в Los Angeles (1). Проблемът с резистентната на много лекарства туберкулоза може да е по-сериозен отколкото се предполага, предупредиха експертите на WHO. Увеличаващата се свръхрезистентна форма на болестта (еxtensively drug-resistant TB – XDR-TB, EDR-TB)** е обезпокоителен факт поради силно ограничените възможности за нейното лечение и високата смъртност. Резистентността на Mycobacte-rium tuberculosis се дължи на генетична мутация, която прави мутиралият щам резистентен на антитуберкулозните лекарства. Потвърждава се лаборатно в инфектирани изолати на пациентите с туберкулоза. MDR-TB се дължи на неадекватно лечение със стандартната първа линия антитуберкулозни лекарства (кратък курс на терапия). XDR-TB е резултат на неправилно и непълно лечение на MDR-TB с втора линия туберкулостатици. Тази форма на болестта е още по-резистентна от MDR-TB и поради това е много трудна за терапевтично повлияване. Лечението на TB и MDR-TB е много отговорна задача и трябва да се провежда съгласно приетите международни стандарти. През 2006 година Световната здравна организация издаде указания за диагностика и лечение на TB - International Standards for Tuberculosis Care (ISTC), чиито пълен текст можете да прочетете на адрес www.who.int/tb/publications/2006/istc_report.pdf. Всички пациенти с необяснима с друга причина продуктивна кашлица с продължителност две-три седмици трябва да бъдат изследвани за ТВ. Около 450 000 души развиват MDR-TB годишно (3% от новодиагностицираните случаи на туберкулоза). Това е форма на болестта, при която стандартната терапия с rifampicin (rifampin) и izoniazid не постига отговор. Може да се предава от човек на човек. XDR-TB е форма на болестта, която е резистентна на най-ефективните антитуберкулозни лекарства и се дължи на лош контрол на MDR-TB, особено при инфектираните с HIV пациенти. Може да се предава от човек на човек. Според Световната здравна организация, около една трета от световната популация е заразена с микобактерия (приблизително два милиарда души), като един от 10 инфектирани развива активна туберкулоза (2). През 2004 година са били диагностицирани девет милиона нови случаи на ТВ в света, която е причинила смъртта на два милиона. Туберкулозата остава втората по честота причина за смъртност от инфекциозни заболявания сред възрастното население на планетата. Над 85% от смъртните случаи, причинени от ТВ, са сред инфектирани с HIV пациенти, като болните с ЕDR-TB обикновено преживяват от четири до шест седмици след поставянето на диагнозата. През март 2006 година, референтната лаборатория към WHO докладва резултати от анализ на около 18 000 позитивни за M. tuberculosis изолати в 45 страни, 20% от които са били с MDR-TB и 2% с XDR-TB, която е дефинирана като in vitro резистентност към три или повече от шестте класа медикаменти за втора линия на лечение на TB (аминогликозиди, полипептиди, флуорохинолони, тиоамиди, cycloserine и пара-аминосалицилова киселина). Особено високи нива на резистентност има в страните от бившия Съветски съюз и Китай. Най-много са новите случаи на MDR-TB в Казахстан, Узбекистан, Естония, Литва, Латвия, китайските провинции Ляонин и Хънан (3). В районите с висока честота на HIV/СПИН в субсахарна Африка разпространението на ЕDR-TB е подобно на нозокомиалните инфекции, с висок процент на трансмисия в контролирани среди като клиники и болници. 23% от изолатите при HIV позитивни пациенти в Южна Африка са резистентни на kanamycin и ciprofloxacin, като смъртността при тях е 98% за 16 дни. 28% са получавали антиретровирусна терапия. Експертите по туберкулоза смятат, че проблемът се дължи на неправилния режим на терапия с антибиотици (незавършване на пълния курс на лечение) и лошите медицински грижи, които са свързани с невъзможността за изолиране и терапия на пациентите в болници или специализирани санаториуми. Новостите в молекулярната биология, както и изясняването на механизмите на лекарствената резистентност на Mycobacterium tuberculosis, доведоха до разработването на нови методи за по-бързо идентифициране на микобактериите и за установяване на тяхната лекарствена резистентност. Като цяло методите изискват скъпо и сложно оборудване, но те са високо специфични и чувствителни за ранна диагностика на заболяването, което протича с олигобацилерност (4). Широко приложение намират методите за доказване на ДНК на причинителя in vitro особено при некултивируеми микобактерии или за контрол на лечението: - ДНК амплифициращи методи - полимеразно-верижна реакция (commercial и in-house PCR методи)*** - използване на ДНК проби Одобрени са два теста за изследване: Amplicor Mycobacterium Tuberculosis Test (Roche Diagnostic Systems) и Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test (MTD; Gen-Probe). Amplicor е ДНК метод, който използва ген-специфични праймери за увеличаване на копията на гена 16S rRNA, които се установяват посредством колориметрична реакция. Тестът се основава на нуклеотидните разлики между тях в 16S rRNA район и може да бъде проведен във всякакъв материал или култивирани клетки. MTD тестът се базира на повишаването на количеството на 16S рибозомални транскрипти, които се установяват с ДНК проба. Особености на тестовете са: - регионът 16S rRNA позволява прецизно видово разграничаване - лесно идентифициране на смесени популации и бърз скрининг на колониите - приложим за ранна култура и не изисква морфологичен анализ на колониите - възможност за мануално и автоматично провеждане на теста - лесна за изпълнение процедура - бърза визуална интерпретация И двата метода са одобрени за директно откриване на микобактериите в положителни проби, като MTD наскоро беше одобрен и за използване при отрицателни проби на суспектни за ТВ пациенти. PCR в реално време е чувствителен (до 98%) и специфичен (100%) метод, като основно негово предимство е експресността на получаване на резултатите – 1.5-2 часа след екстракцията на ДНК и ниската степен на контаминация. Използва се също за установяване на лекарствена резистентност. BACTEC 460 ТВ е радиометрична културална система, съдържаща течна хранителна среда с палмитинова киселина и белязан С14. Когато туберкулозните бактерии започнат да се размножават, радиоактивната съставка се разпада като брояч следи непрекъснато за увеличаващата се радиоактивност посредством отделящият се въглероден окис. Индикаторен тубус за микобактериален растеж (Mycobacterial Growth Indicator Tube – MGIT) – базира се на флуоресцентно установяване на растежа на микобактериите в тубус, който съдържа модифицирана Middlebrook 7H9 среда и на дъното на който има кислороден сензор. При оглед с ултравиолетова светлина при размножаването на туберкулозните бактерии, употребата на кислород от средата води до флуоресценция. С MGIT и BACTEC, освен бързото изолиране на патогена, може да се определи и чувствителността му към туберкулостатиците, като изследването приключва за около три седмици. Установяване на лекарствена резистентност чрез генотипни и фенотипни методи Предимствата на генотипните методи са краткото време за получаване на резултатите, липсата на нужда от растеж на туберкулозните бактерии, възможността за директно приложение в клинични условия. Те се използват за установяване на генни детерминанти за резистентност и се базират на: - амплификацията на нуклеотидните киселини, подобно на PCR, за установяване на определени участаци от генома на M. tuberculosis, за които се знае че са изменени при различните резистентни щамове - оценка на амплифицираните продукти за специфични мутации, корелиращи с резистентността ДНК последователността (DNA sequencing) е „златен стандарт” за установяването на мутациите. Използва се широко за охарактеризиране на мутациите на гена rpoB при rifampicin-резистентните щамове и за установяване на мутации, отговорни за резистентността към другите туберкулостатици. Хибридизационни методи в твърди среди (Solid-phase hybridization techniques) – към настоящия момент се използват Line Probe (INNO-LiPA Rif.TB; Innogenetics) за установяване на rifampicin-резистентност и GenoType MTBDR (Hain Lifesciences) за едновременното установяване на резистентност към isoniazid и rifampicin посредством откриването на най-често срещаните мутации на гените katG и rpoB. Предимства на тестовете: - установяване на туберкулозния бактерий и неговата чувствителност/резистентност към isoniazid и rifampicin - установяване на смесени популации, позволяваща ранно откриване на резистентни щамове - бърза визуална интерпретация - получаване на значително по-бърз профил на резистентност в сравнение със стандартните тестове - възможност както за мануално, така и за автоматизирано провеждане на тестовете Резултатите от проучване на Hillemann и сътр. (5) показаха, че 99% от мултирезистентните щамове са с мутация в гена rpoB и 88.4% с мутации в кодона 315 на гена katG. Биочипове (biochips) – използват се главно за установяване на резистентност към rifampicin. Фенотипните методи оценяват инхибирането на микобактериалния растеж от туберкулостатиците. MGIT е нова генерация диагностичен метод за бързо установяване на резистентност, който може да се използва при медикаментите от първа и втора линия за лечение на ТВ. Фагобазиран анализ (Phage-based тест) - FastPlaque TB се използва основно за установяване на резистентност към rifampicin. Нитрат-редуктазният анализ се използва като алтернативен метод за установяване на резистентност към туберкулостатиците от първа линия (isoniazid, rifampicin, ethambutol и streptomycin). Методът се основава на възможността на M. tuberculosis да превръща натрата в нитрит, който се улавя от реактив в културалната среда. Резистентните щамове намаляват нитрата като средата се оцветява в розово-червен цвят, а чувствителните щамове губят тази способност под действието на антибиотика. Всичките изолирани досега щамове на Mycobacterium tuberculosis са проучени и сравнени с пропорционалния метод - посявка в средата на Loewenstein–Jensen, като са установени индентични резултати в 98.8% от случаите. За разлика от посявкта в средата на Loewenstein–Jensen, резултатите от нитрат-редуктазния анализ са готови на десетия ден. (КП) * MDR-TB - форма на туберкулоза, причинена от M. tuberculosis, който е резистентен най-малкото на rifampicin и isoniazid. Потвърждава се лабораторно с установяване на in vitro резистентен щам към ефектите на двете най-ефективни първа линия антитуберкулозни лекарства. Да се има предвид, че към рифамицините (rifampicin, rifabutin, rifapentene, rifalazil) се развива кръстосана резистентност Лечението се провежда с режими, включващи втора линия туберкулостатици, като терапията се провежда с най-малко четири лекарства, на които щамът е чувствителен, за период от поне 18 месеца (24 месеца при „хронични случаи” с екстензивно белодробно възпаление). Указанията на СЗО от 2006 година за поведение при туберкулоза, резистентна на много лекарства, можете да прочетете на адрес:http://whqlibdoc.who.int/publications/2006/9241546956_eng.pdf Capreomycin (Capastat на Eli Lilly) e бактерицидно средство, което се прилага за лечение на белодробни инфекции, причинени от capreomycin-чувствителни щамове на M. Tuberculosis, когато първа линия терапията (isoniazid, rifampicin, ethambutol и streptomycin) са неефективни или не могат да бъдат използвани поради токсичност или наличието на резистентни туберкулозни бактерии. Cycloserine (Seromycin на Eli Lilly) е бактериостатично средство, което е показано за лечение на активна белодробна и извънбелодробна туберкулоза (включително бъбречна) и чувствителност на причинителя при условие, че първата линия терапия (isoniazid, rifampicin, ethambutol и streptomycin) е доказано неадекватна. ** XDR-TB - форма на болестта, причинена от M. tuberculosis, който е резистентен на всички флуорохинолони и на поне един от трите инжекционни втора линия антитуберкулозни медикаменти (amikacin, kanamycin и capreomycin), в допълнение на неговата резистентността към rifampicin и isoniazid *** Сommercial методите са автоматизирани техники, които използват готови китове, а in-house методите - собствени разработени лабораторни протоколи с преобладаване на извършвани на ръка манипулации Използвани източници: 1. 14th Annual conference of retroviruses and opportunistic infections February 25 - 28, 2007, Los Angeles www.hivandhepatitis.com/2007icr/croi/main.html 2. Global tuberculosis control: surveillance, planning, financing. Geneva: World Health Organization, 2006:1-242www.who.int/tb/publications/global_report/2006/en/index.html 3. Aziz M., Laszlo A. et al. Epidemiology of antituberculosis drug resistance (the global project on anti-tuberculosis drug resistance surveillance): an updated analysis. Lancet 2006; 368: 2142–54www.thelancet.com 4. Palomino J. Newer Diagnostics for Tuberculosis and Multi-Drug Resistant Tuberculosis. Curr Opin Pulm Med. 2006;12(3):172-178www.co-pulmonarymedicine.com 5. Hillemann D., Weizenegger M., Kubica T. et al. Use of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complex isolates. J Clin Microbiol 2005; 43:3699-3703http://jcm.asm.org